细胞治疗实体瘤大比拼，CAR-NKT完胜CAR-T！《Nature》子刊：北卡大学改造NKT细胞打击M2巨噬细胞，抗癌效果大增
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作者：戴维 | 主编：摩西
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过去10年，CAR-T疗法在对付血液肿瘤上简直是无往不利，但一旦遇到实体瘤，它就像个英雄被困在泥潭里，步履维艰。
不过别急，来自北卡罗莱纳大学医疗保健中心的研究人员最近改造出了新的“超级战士” -- CAR-NKT细胞！和CAR-T相比，CAR-NKT细胞不仅能精准打击表达CD1d的“坏巨噬细胞”，还能激发T细胞对肿瘤的新反应，堪称“肿瘤界的清道夫”。
这一发现为实体瘤治疗提供了全新思路，CAR-NKT疗法有望成为免疫治疗领域的新明星！
2017年，首个CAR-T疗法（Kymriah）获得了美国食品药品监督管理局（FDA）的批准用于治疗复发性或难治性的急性淋巴细胞白血病，随后几种CAR-T疗法相继上市，用于不同类型的血液肿瘤。自此，CAR-T疗法在血癌领域已有将近10年的发展和应用，并取得了显著进展。
CAR-T疗法的基本策略
但CAR-T疗法在对抗实体瘤时，临床效果仍然十分有限。造成这种差异的原因有很多，例如缺乏可以靶向的肿瘤特异性抗原、肿瘤物理屏障的存在，以及肿瘤微环境（TME）的复杂性。为了克服这些挑战，科学家们正在开发并测试多种对抗策略，包括基因工程和联合疗法。此外，像NK细胞、γδT细胞和NKT细胞等具有天然抗肿瘤能力的免疫细胞，也是CAR治疗策略的大热点。
NKT细胞是一类异质的T细胞，与T细胞和NK细胞拥有部分相同的特征
NKT细胞是一类独特的T细胞亚型，它们在血液中的数量非常少，仅占人体外周血单个核细胞的不到0.1%。它们不仅能像NK细胞那样快速杀伤细胞和分泌细胞因子，还能通过CD1d识别特殊的抗原，而不是像普通T细胞那样通过MHC识别肽类。NKT细胞在调控免疫反应、防止过度免疫激活方面起着关键作用，同时也能够对肿瘤发起免疫攻击。
在某些癌症中，NKT细胞的数量增加与更好的治疗效果有关。虽然大多数实体瘤没有表达CD1d，但NKT细胞仍然能够响应某些化学信号迁移至肿瘤，并在肿瘤微环境中清除促肿瘤的M2型巨噬细胞。
NKT细胞根据CD1d这个靶点来识别肿瘤细胞
基于这些独特的特性，研究人员开始探索将NKT细胞作为CAR治疗的平台。早期研究表明，经过基因工程改造的NKT细胞能够通过CAR靶向杀伤肿瘤细胞，并保留其自然功能去攻击CD1d阳性的细胞。
在北卡大学的最新研究中，使用表达CAR的NKT细胞不仅能直接攻击肿瘤，还能增强身体自身的T细胞反应。与传统T细胞相比，NKT细胞在处理复杂的肿瘤微环境时展现了更好的表现。例如，在某些研究中，NKT细胞还能抑制肿瘤微环境中的抑制性细胞，这将进一步增强它们的抗肿瘤效果。
一、长江后浪推前浪，CAR-NKT 细胞更要强
为了比较CAR.CD19 NKT细胞和CAR.CD19 T细胞在体内对抗肿瘤的效果，研究团队也是煞费苦心。首先，他们使用了一种特殊的小鼠模型（B16-OVA-hCD19黑色素瘤模型）。在实验开始前，研究人员给小鼠注射了环磷酰胺，这样可以轻微降低它们的淋巴细胞数量。在这个模型中，研究发现CAR-T细胞对肿瘤生长的抑制效果相对较小。
此外，研究人员还从接受CAR-T细胞治疗的小鼠中收集了肿瘤组织，发现其中浸润了CD11b+F4/80+巨噬细胞和髓源性抑制细胞（MDSCs），包括两种不同类型的MDSCs（PMN-MDSCs和M-MDSCs）。这两种细胞在肿瘤微环境中起着重要的作用，特别是MDSCs，它们通常会抑制免疫反应，从而帮助肿瘤生长。有趣的是，许多在肿瘤边缘的F4/80+巨噬细胞也表达了一种标志物（CD206），这表明它们可能已经改变了其功能，表现出M2型极化的特征。M2型巨噬细胞通常与肿瘤的生长和修复过程相关，它们能够促进肿瘤的进展，而不是直接攻击肿瘤细胞。
CAR-NKT细胞表现出优于CAR-T细胞的抗肿瘤活性
在该模型中，研究团队还比较了CAR-T细胞和CAR-NKT细胞的抗肿瘤能力，结果显示CAR-NKT细胞对肿瘤的控制效果更佳，并且能够延长小鼠的生存时间，而且没有明显的毒性。此外，在另一个增加肿瘤负担的实验中，CAR-NKT细胞同样表现出了良好的抗肿瘤效果。
为了进一步确认CAR-NKT细胞在不同类型肿瘤模型中的优势，研究人员建立了两种额外的肿瘤模型：一种是通过静脉注射B16-OVA-hCD19细胞创建的转移模型，另一种是通过腹腔植入表达小鼠自体抗原B7-H3的ID8肿瘤细胞创建的卵巢癌模型。在这两种模型中，研究人员都观察到了巨噬细胞的浸润，而CAR-NKT细胞在抗肿瘤效果上优于CAR-T细胞。
总的来说，这些数据都表明CAR-NKT细胞在体内对抗肿瘤的效果要优于CAR-T细胞。
二、破巢之下无完卵，CAR-NKT 细胞铲除“保护伞”
在研究 CAR-NKT 细胞对抗肿瘤的机制时，科研人员首先关注了 CAR（嵌合抗原受体）的表现。实验涉及到两种小鼠模型：一种是 CD45.2 型小鼠，另一种是 CD45.1.2 型小鼠。科研人员分别从这两种小鼠中生成 CAR-NKT 细胞，并将它们注入到携带 B16-OVA-hCD19 肿瘤的 CD45.1 型小鼠体内。通过观察肿瘤和引流淋巴结中 CAR-NKT 细胞和 CAR-T 细胞的浸润情况及存活率，科研人员发现 CAR-NKT 细胞在肿瘤内部的积累相对较少，但在肿瘤引流淋巴结中的积累却更为显著！
进一步研究发现，NKT 细胞会表达高水平的 TRAIL（肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体），它可以诱导肿瘤细胞的凋亡。科研人员分析了由 CAR-NKT 细胞或 CAR-T 细胞处理的小鼠肿瘤中细胞死亡相关蛋白的表达。结果显示，无论采用哪种治疗方式，肿瘤细胞的死亡与裂解的 caspase-3 水平密切相关，而 CAR-NKT 细胞治疗产生的 CC3 水平显著高于 CAR-T 细胞。
科研人员进一步假设，CAR-NKT 细胞的优越抗肿瘤活性与其调节肿瘤微环境（TME）的能力有关。在治疗第 16 天，科研人员收集了 B16-OVA-hCD19 肿瘤，分析了不同组别的免疫细胞浸润情况。通过单细胞 RNA 测序，科研人员发现所有四组都有不同的白细胞浸润情况，其中 CAR-NKT 细胞的治疗组显示出对免疫抑制性巨噬细胞（TAM2）、嗜碱性粒细胞和中性粒细胞的显著减少。这表明CAR-NKT细胞可能通过抑制特定的免疫抑制细胞，增强抗肿瘤免疫反应，从而提高治疗效果。
CAR-NKT细胞在体外调节TME并靶向巨噬细胞
此外，研究还显示，与未转导的 NKT 细胞相比，CAR-NKT 细胞的频率也出现了增加，同时单核细胞和 TAM2 细胞的耗竭现象明显。科研人员对 CAR-NKT 细胞与巨噬细胞的相互作用进行了比较，发现这两种细胞都能有效清除多种类型的巨噬细胞，并能分泌 IFN-γ，而 CAR-T 细胞则未能清除这些巨噬细胞。
通过进一步分析，科研人员发现 CAR-NKT 细胞处理的小鼠比 CAR-T 细胞处理的小鼠有更多的免疫细胞浸润，尽管 CD4+ 和 CD8+ T 细胞的频率变化不大，但 CAR-NKT 细胞显著减少了肿瘤中的 TAMs。免疫荧光分析结果表明，CAR-NKT 细胞和对照 NKT 细胞减少了肿瘤中 M2 型巨噬细胞的浸润，而 M1 型巨噬细胞的数量没有变化。
CAR-NKT细胞减少TME内的TAM
最后，为了证明 CAR-NKT 细胞介导的 M2 型巨噬细胞减少是 CD1d 依赖性的，科研人员在 CD1d 敲除小鼠中建立了相应的肿瘤模型。结果显示，在这一模型中，CAR-NKT 细胞和 CAR-T 细胞表现出相似的抗肿瘤活性，且没有明显的毒性反应。综合来看，CAR-NKT 细胞的抗肿瘤能力强于 CAR-T 细胞，这种优势在于对 M2 型巨噬细胞的选择性减少，而低表达 CD1d 的 M1 型巨噬细胞则不受影响。
三、运筹帷幄决胜千里，CAR-NKT 细胞重新激活免疫军团
在这项研究中，研究团队其实还有一项突破性进展，他们发现B16-OVA-hCD19肿瘤表面有一种叫做OVA的抗原，这种抗原能引发强烈的免疫反应。因此，研究团队想知道CAR-NKT细胞是否能够通过刺激“表位扩散”并激活体内的OVA特异性T细胞，以此来增强抗肿瘤的效果。
首先，研究团队创造了一种只表达人类CD19的肿瘤细胞系B16-hCD19，并将其注入小鼠。接着，研究团队给这些小鼠注入了CAR.CD19 NKT细胞和CAR.CD19 T细胞。结果发现，CAR-NKT细胞的抗肿瘤效果明显优于CAR-T细胞，但与B16-OVA-hCD19模型中的效果相比，差距不那么明显。这到底是为什么呢？
为了进一步了解CAR-NKT细胞对OVA特异性T细胞的激活，研究团队分析了接受不同治疗的小鼠的肿瘤。结果显示，接受CAR-NKT细胞治疗的小鼠肿瘤中，OVA特异性CD8+ T细胞的数量显著多于接受CAR-T细胞治疗的小鼠。此外，CAR-NKT细胞治疗的小鼠中，NK细胞的数量也显著增加，这表明CAR-NKT细胞能够有效增强抗肿瘤免疫反应，促进OVA特异性T细胞和NK细胞的激活与增殖。CAR-NKT细胞不仅能直接攻击肿瘤细胞，还能通过激活特定的T细胞增强整体免疫反应！
CAR-NKT细胞通过增强DC激活促进T细胞反应
此外，研究团队还发现接受CAR-NKT细胞治疗的小鼠肿瘤中DC细胞的数量更多，且这些细胞的CD80和CD103表达水平要高于接受CAR-T细胞治疗的小鼠。这表明它们的抗原提呈水平也增加了，免疫系统可以更容易发现这些肿瘤细胞，增强了整体的抗肿瘤能力。
最后，在某些特定的小鼠模型中，研究团队没有发现OVA特异性CD8+ T细胞的增加，这表明CAR-NKT细胞与DC之间的相互作用还是依赖于CD1d的。
四、如虎添翼，PD1阻断疫苗助力CAR-NKT细胞所向披靡
我们都知道，在免疫系统中，T细胞是抵抗肿瘤和病毒的重要战士。然而，随着时间的推移，这些细胞有时会变得“疲惫”，不再有效地发挥作用，这种现象被称为“T细胞耗竭”。虽然CD8+ T细胞的耗竭现象已被广泛研究，但对自然杀伤T细胞（NKT细胞）和CAR-NKT细胞（通过基因工程改造的NKT细胞）的耗竭研究相对较少。
为了改变这种情况，研究团队在B16-OVA-hCD19模型小鼠身上注入了来自另一组小鼠的CAR.CD19 NKT细胞。这使得研究人员能够观察这些CAR-NKT细胞是否会随着时间的推移而变得疲惫。在观察过程中，研究人员发现这些细胞中一些重要的“疲惫”标记物（PD1和TIM3）的数量逐渐增加，显示出它们的抗肿瘤能力正在减弱。同时，这些细胞分泌的干扰素-γ（IFN-γ）和格朗齐酶B（GrB）在最初几天内有所增加，但在后期却有所下降。
接下来，研究团队使用了高肿瘤负担的模型，结合较低剂量的CAR.CD19 NKT细胞，以模拟慢性抗原刺激对这些细胞的影响。在这一实验中，研究人员发现，单独使用CAR-NKT细胞或阻断PD1的药物都能够适度延缓肿瘤的生长。然而，当将这两种治疗结合起来时，肿瘤的生长得到了显著的控制。这表明，联合作用可能会产生更强的抗肿瘤效果！
抗 PD1 治疗和疫苗接种在高肿瘤负荷模型中增强 CAR-NKT 细胞的抗肿瘤能力
研究还显示，结合PD1阻断与CAR.CD19 NKT细胞的治疗可以增加肿瘤内NKT细胞的数量，并提高分泌IFN-γ和GrB的细胞比例，这可能使肿瘤更容易受到攻击。
最后，研究团队总结了这样一种新的策略：通过PD1阻断疫苗接种来增强CAR-NKT细胞的抗肿瘤效果。研究发现，当使用一种名为α-GalCer的物质与树突状细胞（DCs）或多阶段载体结合时，能够进一步提升NKT细胞的抗肿瘤活性。经过实验，研究人员发现这些疫苗不仅提升了CAR-NKT细胞的能力，还延缓了肿瘤的进展，显示出疫苗与免疫细胞结合使用的强大潜力，为未来的癌症治疗提供了新的思路。
五、总结与展望
作为一种新兴的免疫疗法，CAR-NKT细胞在治疗神经母细胞瘤（NBL）这种实体肿瘤时，已经显示出了良好的临床效果，并且能够显著扩增到临床规模。这项研究的关键在于开发适当的临床前模型，以评估NKT细胞与免疫系统之间复杂的相互作用，这些在传统的免疫缺陷小鼠模型中是无法充分体现的。
北卡大学的研究团队采用了多种同基因肿瘤模型，展示了自体CAR-NKT细胞相比于CAR-T细胞具有更强的抗肿瘤活性。CAR-NKT细胞通过多种机制发挥这种优势：一方面，它们能够通过特异性靶向肿瘤细胞直接进行攻击；另一方面，它们还可以消除M2样巨噬细胞，并通过NKT-iTCR与肿瘤微环境中的抗原呈递细胞（如树突状细胞和肿瘤相关巨噬细胞）上表达的CD1d相互作用，从而刺激内源性T细胞的反应，并激活免疫系统。
此外，研究团队还创新性地结合了PD-1阻断和疫苗接种，使得CAR-NKT细胞的抗肿瘤活性进一步得到增强。
总之，这些发现证明了CAR-NKT细胞在实体瘤治疗中发挥的多重作用，进一步支持了它们在临床研究中的应用潜力。希望未来的研究能够揭示其更广泛的临床应用价值，为实体瘤癌症患者带来新的希望！
References
[1]Zhou X, Wang Y, Dou Z, Delfanti G, Tsahouridis O, Pellegry CM, Zingarelli M, Atassi G, Woodcock MG, Casorati G, Dellabona P, Kim WY, Guo L, Savoldo B, Tsagaratou A, Milner JJ, Metelitsa LS, Dotti G. CAR-redirected natural killer T cells demonstrate superior antitumor activity to CAR-T cells through multimodal CD1d-dependent mechanisms. Nat Cancer. 2024 Oct 1. doi: 10.1038/s43018-024-00830-0. Epub ahead of print. PMID: 39354225.
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